产品货号:
KL221127
中文名称:
植物线粒体RNA提取试剂盒
英文名称:
Plant Mitochondrial RNA Extraction Kit
产品规格:
5T
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本制品是专门用于植物细胞线粒体RNA纯化的试剂盒。
保存:包装一置于室温,包装二置于-20℃,有效期1年。
超纯水、5M KOH(调pH用)、0.5M EDTA溶液、75%乙醇。
一、准备工作
二、线粒体粗提操作流程
三、细胞核DNA的去除(纯化测序级的线粒体RNA才需要进行此操作)
四、线粒体精提操作方案(需要40000g的超速冷冻离心机)
五、线粒体RNA的提取
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植物线粒体是重要的植物细胞器,负责植物细胞ATP的产生。此外,植物很多重要的特性(如雄性不育)也跟线粒体相关,是母系遗传研究的重要材料,因此常常需要进行线粒体RNA纯化。
- 即用型试剂盒,用户不需要单独配制各种溶液或优化操作流程。
- 提供粗提和精提两种操作方案。粗提只需常规台式冷冻离心机,利用差速分离原理进行线粒体粗提,所得线粒体虽然含少量其他细胞器污染,但可用于线粒体RT-PCR,不能用于测序。
- 精提需要冷冻超速离心(离心力达40000g),利用密度梯度来将粗提制备的线粒体和其他细胞成分进一步分开,得到线粒体精提液,适用于后续测序级线粒体RNA提取。
包装 | 组分 | 规格 |
包装一 | 植物线粒体提取匀浆液 | 250mL |
植物线粒体提取洗涤液 | 250mL×2 | |
植物线粒体提取离心介质 | 150mL | |
带柄尼龙筛 | 1个 | |
软毛笔 | 1只 | |
Percoll | 50mL | |
詹纳斯绿B染色液(0.2%) | 1mL | |
细胞器RNA纯化溶液A | 5mL | |
细胞器RNA纯化溶液B | 1mL | |
细胞器RNA纯化溶液C | 5mL | |
包装二 | 25mM MgCl2溶液 | 0.2mL |
0.5M EDTA溶液 | 1.5mL | |
BSA干粉 | 10g | |
DNase A干粉 | 5mg |
保存:包装一置于室温,包装二置于-20℃,有效期1年。
本试剂盒足够5次提取,每次可处理10g绿色植物组织(可得1~2.5mg左右线粒体)或20g非绿色植物组织(可得2~5mg左右的线粒体)。
超纯水、5M KOH(调pH用)、0.5M EDTA溶液、75%乙醇。
线粒体膜对温度高度敏感,所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行,所用植物组织,器皿和溶液均需要在4℃预冷。任何情况下线粒体的温度都不要超过4℃。
一、准备工作
- 植物组织不同,线粒体产率不同,请以下表为参考:
植物组织种类 线粒体产率 说明 根和块茎 0.3mg/10g 如土豆,红薯等 黄化苗(下胚轴、子叶、胚芽鞘) 2~5mg/10g 指多酚含量低的叶片 有光合作用的叶片和子叶 1~2.5mg/10g 需放置在暗处3天 - 线粒体纯化最好选用黄化苗。如果用绿色组织(如叶片),需将植物提前放在暗室至少3天以降低淀粉含量,否则淀粉颗粒将严重干扰线粒体的纯化。
- 一次线粒体纯化实验需要10g绿色植物组织(或20g干净的非绿色植物组织)、40mL匀浆液、90mL洗涤液和35mL密度梯度离心介质。密度梯度离心介质的配制方法是一次性将9.8g(=8.7mL)Percoll加入到26.3mL离心介质中,充分混匀后得到35mL密度梯度离心介质。上述三种溶液(匀浆液、洗涤液和加入了Percoll的离心介质)用前均需要先加入0.1%BSA干粉(100mL溶液加0.1g BSA干粉),轻柔颠倒混匀溶解后放冰上预冷待用。每次实验用多少配多少,不要预先将所有BSA干粉加入。
二、线粒体粗提操作流程
- 将10g的绿色植物组织(去叶脉后的嫩叶子或愈伤组织)或20g干净的非绿色植物
组织(如发芽组织、根、块茎等)浸泡在冰水中10分钟,取出用纸吸干液体后浸泡在预冷的40mL匀浆液(已加BSA)中,在浸泡状态下剪成1cm2大小的碎片。- 处理样品量太大的话,可能超出裂解液的裂解能力,线粒体产率会急剧降低,所以如果需要放量处理同一样品,可分成多个组平行处理,得到线粒体粗提物后再汇集。
- 将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到Waring匀浆器(打水果汁的匀浆器)中,中速匀浆3次,每次15秒,每次之间间隔10秒以便让碎片沉淀到刀片处。也可使用研磨法,具体操作是将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到预冷的研钵中,研磨3~4分钟。
- 植物组织匀浆后释放的物质会使匀浆液酸化,降低pH,而线粒体对pH变化非常敏感,因此建议匀浆后用pH试纸检测匀浆液的pH,如果低于7.0,必须用自备的5M KOH将pH调到7.0以上才进入下一步。
- 用试剂盒提供的带柄尼龙筛过滤匀浆液,穿透液可通过预冷的漏斗收集到预冷的50mL的塑料离心管中。本试剂盒提供的一个带柄尼龙筛可以洗干净后反复使用。
- 在低速固定角度冷冻离心机上4℃ 1000g离心匀浆液5分钟,上清含线粒体,沉淀为未破碎的细胞、破碎细胞的碎片、细胞核和淀粉颗粒等。小心转移上清到新的预冷的50mL塑料离心管中。
- 将含线粒体的离心管在水平冷冻离心机上4℃ 12000g离心20分钟,弃上清液,所得棕绿色沉淀即为纯化的线粒体粗提物。如果沉淀底部还有白色的淀粉沉淀,属于正常现象。
- 在沉淀中加入10mL预冷的洗涤液(已加BSA,下同)中,用软毛笔轻柔重悬线粒体沉淀(如果最底下有白色淀粉沉淀,避免重悬之)。不能剧烈震荡,否则线粒体容易破裂。本试剂盒提供的一只软毛笔可以洗干净后反复使用。
- 将线粒体重悬液转移到新的50mL离心管中,再加入30mL预冷的洗涤液,4℃ 1000g离心5分钟。线粒体将在上清中。
- 将上清转移到新的预冷的50mL离心管中,4℃ 12000g离心20分钟,沉淀为线粒体。小心弃上清。到此步时,线粒体回收率一般在15~30%之间。
- 在线粒体沉淀中加入2mL预冷的洗涤液。轻柔重悬,得到线粒体粗提液。如果有平行提取,可将最多4管线粒体沉淀重悬在2mL洗涤液中。
- 在显微镜下检测重悬液中线粒体的完整性。具体做法是先滴一滴(约50μL)线粒体粗提液到载玻片上,再滴入50μL 0.2%詹纳斯染液绿B染色液,混匀后20分钟,油镜下观察,蓝绿色颗粒状物即为线粒体。
- 所得线粒体粗提液往往含其他细胞器(如类囊体膜,质体,过氧化物酶体,乙醛酸循环体,或细菌)污染,但可直接用于PCR级线粒体DNA和RNA的提取。如果需要长期保存,则直接放-80℃保存。如此保存的线粒体RNA完整性在几年内都不会变化。
三、细胞核DNA的去除(纯化测序级的线粒体RNA才需要进行此操作)
- 预留50μL线粒体粗提液作对照,在约2mL剩余的线粒体粗提液中加入40μL 25mM MgCl2,再加入1mg DNase A干粉,混匀后冰上放置60分钟降解DNA。然后取50μL线粒体样品到一干净离心管中,剩下样品继续放冰上酶切DNA。将取出的50μL样品在PCR仪器中加热到95℃变性10分钟灭活DNase A,再取其中的1~10μL做模板,用1~10μL预留的线粒体粗提液做对照,一起进行细胞核基因专一性PCR(需要用户自己设计引物和自备PCR试剂),如果DNase A处理过的样品没有扩增,而预留样品有扩增,则表明基因组DNA去除比较干净(达到PCR检测的极限),则进入下一步。如果未去除干净,则继续在冰上放置,直到PCR检测不到细胞核DNA。
- 加入0.3mL预冷的0.5M的EDTA溶液终止反应。
- 再加入40mL预冷的洗涤液,4℃ 1000g离心5分钟,将上清转移到新的预冷的50mL离心管中。
- 将上步离心管放4℃ 12000g离心20分钟,沉淀为去除细胞核DNA之后的线粒体。重悬在2mL洗涤液中。
- 在显微镜下检测上清液中线粒体的完整性。具体做法是先滴50μL左右的线粒体重悬液到载玻片上,再滴入50μL 0.2%詹纳斯染液绿B染色液,染色20分钟,油镜下观察,蓝绿色颗粒状物即为线粒体。
四、线粒体精提操作方案(需要40000g的超速冷冻离心机)
- 在50mL预冷的塑料离心管中先后加入35mL预冷的密度梯度离心介质(配制方法见第3步,用前需先加BSA)。
- 将第18步所得的2mL线粒体粗提物重悬液铺在密度梯度离心介质上。
- 在超速水平离心机上4℃ 40000g离心45分钟,最上层为黄色或橙色的质体带(如果材料是绿色植物,此带将是绿色),其下的白色不透明的带即为线粒体,管底沉淀为过氧化物酶体。其示意图如下:
- 用广口吸管(可将1mL蓝抢头中间剪断后使用)收集线粒体带,注意避开其上的质体带过氧化物酶体沉淀,估计所取含线粒体带的体积。
- 在15~20分钟的时间内缓慢加入至少4倍体积的预冷的洗涤液。
- 转入50mL塑料管离心管中,在冷冻离心机上4℃ 15000g离心20分钟,沉淀为线粒体。可以直接进入第26步进行RNA提取。如果暂时不提取RNA,则把线粒体沉淀放-80℃保存。
五、线粒体RNA的提取
- 在上步所得的线粒体沉淀中加入1mL细胞器RNA提取溶液A,用移液枪充分吹打。
- 再加入200μL细胞器RNA提取溶液B,颠倒数次混匀。
- 室温放置5分钟。
- 14000g室温离心5分钟。小心转移上清液(约0.7mL)到一个新的1.5mL塑料离心管中,避免触及中间层的白膜。
- 加入1倍体积的细胞器RNA提取溶液C(用前颠倒摇晃均匀)到上清液中,用手上下颠倒30秒混匀。
- 14000g室温离心10分钟,小心弃上清。
- 在离心管中加1mL 75%乙醇,短暂震荡,14000g室温离心3分钟,弃上清。
- 短暂离心,小心吸弃残留的液体(约50μL)。此步不要省略,否则残留的液体(含乙醇)将会影响后续反应。
- 立即加入30μL超纯水充分溶解线粒体RNA沉淀。
- 直接取1μL在NanoDrop上测OD计算浓度和纯度,其余样品放-80℃保存备用。
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